华中农大陈伟团队通过mQTL揭示小麦籽粒发育中麦黄酮合成途径

mQTL分析为普通小麦籽粒的发育和营养品质的改善提供了新的生化见解

期刊：PlantCommunications

IF:10.5

发表时间：2024年1月

单位：华中农业大学

2024年1月，华中农业大学陈伟教授团队于PlantCommunications发表题为“Dynamicmetabolic-QTLanalysesprovidenovelbiochemicalinsightsintothekerneldevelopmentandnutritionalqualityimprovementincommonwheat”的研究论文。该研究利用159个重组自交系(RILs)群体，对籽粒灌浆粒(FK)、成熟粒(MK)和萌发粒(GK)三个发育阶段的籽粒进行了广泛靶向的代谢分析。共检测到625个代谢物，随后通过mQTL研究揭示了一个全面的麦黄酮代谢途径及其候选基因。

研究背景

据估计，植物可以合成超过20万种代谢物，小麦（）是世界上最重要的作物之一，尽管近年来作物代谢组学研究取得了一些进展，这扩大了我们对植物代谢的认识，但小麦籽粒代谢组学在不同发育阶段的遗传控制和分子基础仍不清楚。

技术路线

样本：在小麦开花后21天(DPA)和35天(DPA)采集籽粒，分别代表籽粒灌浆期(FK)和籽粒成熟期(MK)。同时，在25℃的黑暗条件下浸泡24小时左右，收集发芽粒(GK)。在这三个时间点收集的小麦籽粒被用来描述种子从成熟到发芽的连续状态。共使用了159个来自Jingdong8（JD）和Aikang58（AK）的RIL系。

技术路线

研究结果

1.小麦3个发育时期的代谢组检测分析

基于先前建立的广泛靶向代谢组学方法(Chenetal.，2013)，共检测到11类625种已知代谢物(氨基酸和衍生物、核苷酸、植物激素及其衍生物、脂质、有机酸、糖、维生素、黄酮类、酚酰胺、其他多酚和其他未分类的代谢物)。这些代谢产物随后在159个重组自交系(RILs)和两个亲本JD8和AK58的小麦籽粒中进行了定量分析。在灌浆、成熟和萌发三个发育阶段采集小麦籽粒样本，以表征种子从成熟到萌发的动态过程,这些代谢物在三个种子阶段表现出相似但不同的广义遗传力和变异系数，这表明在三个种子阶段可能存在共同和特定的代谢物数量性状位点(mQTL)。

为了探究这三个阶段之间的动态变化，将625种代谢物在父本和母本之间的变化趋势分别划分为不显著、上升、下降、上升-下降和下降-上升5类。两个亲本中大部分代谢物在3个发育阶段的含量变化趋势符合趋势1(AK为289、JD为264)，其次是趋势3(AK和JD均下降分别为173和206)和趋势2(AK和JD均上升分别为111和106)。不到十分之一的代谢物属于另外两个趋势(AK中有52个，JD中有49个)，同时，超过三分之二(625个代谢物中的448个)的代谢物在两亲本之间被归为相同的变化趋势。例如，在AK和JD中有196、78和142种代谢物同时归属于趋势1、2和3(图1A)。这些结果表明，代谢物含量在不同发育期(即FK、MK和GK)之间的差异比不同小麦品种之间的差异更显著。

随后，作者进一步量化了在水稻籽粒样本中代谢物含量，发现三个阶段之间的差异普遍高于小麦基因型之间的差异(图1B)，其中趋势1包含的代谢物数量最少(625个代谢物中有12个)，这进一步验证了作者提出的假设，即种子发育阶段含量变化比小麦不同基因型的含量变化更明显。因此，mQTL应该在多个发育阶段进行定位，或者至少幼嫩植株的mQTL不应该作为成熟时的指标。

图1小麦籽粒三个阶段代谢产物的分布规律

2.mQTL定位分析

在LOD(或然率常用对数)≥2.5的阈值下，采用ICIM(包含复合区间定位)方法在FK、MK和GK阶段分别检测到3173、3143和2644个mQTL。这些mQTL分别与三个阶段的614、619和592个代谢物相关，作者推测只有一小部分已定位的代谢物与单个位点相关，经分析发现确实只有46个(614个)、35个(619个)和65个(592个)代谢物分别与FK、MK和GK期的单个位点相关。同时，三个阶段的代谢物图谱存在差异，代谢物mr1117(C-己糖木犀草素、O-对香豆醇己糖)和mr2050(3,4-二羟基扁桃酸)仅在FK阶段被定位，然而，在MK或GK阶段没有代谢物被特异性定位。在7B染色体上发现了代谢物GA19（赤霉素19）三个阶段的共定位位点，IAA(吲哚-3-乙酸)在7A染色体上仅在MK和GK之间发现了共定位位点，p0199(金圣草黄素-5-O-芸香糖甙)在三个阶段的任何两个阶段都没有发现共定位位点。最后，位点/代谢物比率在三个阶段之间可能有所不同。例如，在FK阶段检测到代谢物cZ(顺式玉米蛋白)的7个mQTL位点，而在MK和GK阶段相同的代谢物分别检测到4个和1个mQTL位点。总体而言，与次级代谢物相比，与初级代谢物相关的mQTL较少，例如，在MK阶段，从25个糖中定位99个mQTL——大约是4:1的比例，而在同一阶段，黄酮的位点与代谢物的比例大约是7:1。

已有研究表明，代谢物含量在三个发育期之间的差异比小麦基因型之间的差异更显著(图1)，本研究表明在小麦籽粒发育的三个阶段只有52个mQTL被共同定位(图2A)。同时，无论在FK期、MK期还是GK期，所定位的位点都不均匀地分布在21条染色体上。作者发现位于3A染色体(688个位点)和4D染色体(783个位点)上的mQTL较多，而位于1D染色体(217个位点)和6D染色体(164个位点)上的mQTL较少（图2B）。此外，考虑到代谢物分类所交叉的发育阶段，不同分布的mQTL表现出更复杂的特异性。例如，3D染色体上的mQTL主要由与黄酮类相关的mQTL组成(652个位点中的145个)，其中这些黄酮类mQTL大部分定位于FK期(145个位点中的61个)。同样，7A染色体上的mQTL主要由与植物激素及其衍生物相关的mQTL组成(570个位点中有88个)，其中这些植物激素及其衍生物mQTL在FK期基本缺失(88个位点中有9个)。2B染色体上的mQTL主要由与其他多酚类物质相关的mQTL组成(637个位点中有122个)，这些其他多酚类物质mQTL主要在FK期定位(122个位点中有70个)。这就提出了一个问题，即每种代谢物类别的mQTL是否被小麦的某一个亚基因组优先定位。有趣的是，黄酮类较少被定位在B亚基因组上，而植物激素及其衍生物和其他多酚类物质则优先被定位在A亚基因组上。

图2mQTL数据采集

3.mQTL的候选鉴定

为了探索代谢物含量变化的遗传基础，通过结合小麦基因组注释、化学结构和代谢物所属代谢途径以及与小麦候选基因序列高度相似的同源物的文献报道，初步确定了候选基因。一些新的候选基因在当前的研究中被验证，如与酪胺相关的mQTL在GK期被定位到3A染色体上519.22-532.93Mb的区间(图3A)。(531.63Mb)编码酪氨酸脱羧酶(TyDC)，被指定为该QTL的候选基因。该候选序列与报道的水稻(80.23%的氨基酸相同)和(77.11%的同源性，图3B)具有高度的序列相似性，该候选基因的不同单倍型由亲本系携带保留，其编码的蛋白中含有7种不同的氨基酸(图3A)。

通过体外酶活实验，从双亲(即和)中克隆出，并在大肠杆菌中表达,随后用酪氨酸作为底物对等位基因的酶功能进行了评价。的两个等位基因均能催化酪氨酸转化为酪胺(图3C)，Km=36.35±3.27μM(AK)和12.92±2.38μM(JD)，Kcat=5.32±0.52/s(AK)和9.93±0.51/s(JD，图3D)。AK和JD-之间不同的酶促特性可归因于7种不同的氨基酸(图3A)，-JD对酪氨酸的亲和力较高(由较高的Kcat/Km值表示)。除了不同的催化能力(图3D)是小麦籽粒中酪胺含量的决定因素之一外，候选基因在三个阶段的相对表达也同样重要(图3E)，结果表明在JD中GK阶段较高的表达与GK阶段中较高的酪胺含量是一致的，即使酪氨酸（作为底物）在两个亲本之间没有显著差异(图3F)。

图3候选基因的功能注释

4.跨越三个阶段的遗传图谱助力描绘多步骤的代谢途径

上面我们已经提供了在单个发育阶段与单个代谢物相关的mQTL候选基因的鉴定结果。从理论上讲，多种群组合将有助于识别更多的候选基因，从而描绘更多的代谢途径，在不同发育阶段检测到的mQTL也是如此。例如，代谢物mr1058(麦黄酮)在所有三个阶段都被共同定位到染色体7A上32.00-35.00Mb的区间，其中编码咖啡酰辅酶AO-甲基转移酶的(34.72Mb)被暂时选定为候选基因(图4A)。的蛋白序列与其水稻同源物(ROMT-15)和(ROMT-17)高度相似(图4B)。随后，在两个亲本(即TraesCS7A01G068600-AK和TraesCS7A01G068600-JD，图4A)的序列比较中发现了两个氨基酸的差异，体外酶活分析明确表明，在相同的反应条件下，TraesCS7A01G068600-JD比TraesCS7A01G068600-AK可以产生更多的麦黄酮(图4C)。两种单倍型酶之间的差异可以归因于两种氨基酸(图4A)，随后，将TraesCS7A01G068600-JD中的两个氨基酸残基(Asn位于第172位，Arg位于第221位)分别替换为TraesCS7A01G068600-AK中的对应氨基酸残基(Asp位于第172位，Gly位于第221位)。结果表明，与原TraesCS7A01G068600-JD相比，Asn-to-Asp取代没有Arg-to-Gly取代导致麦黄酮的产量变化（下降）明显(图4C)，表明第221位的Arg/Gly残基是影响该甲基转移酶催化能力的关键残基。这种现象在某种程度上符合预期，因为Asn和Asp在化学上比Arg到Gly的取代更保守。

麦黄酮-7-O-葡萄糖苷(mr1275)是一种糖基化的麦黄酮修饰物，在MK和GK阶段都被定位到2A染色体上35.84-36.88Mb的区间，其中编码糖基转移酶的(30.86Mb)被指定为候选基因(图4D)，其与和其他一些类黄酮糖基转移酶如和具有高度的序列相似性(图4E)。两个亲本单倍型在其蛋白序列的第465个残基上发现了一个氨基酸偏差（AK和JD分别Arg和Gly）(图4D)。TraesCS2A01G070100-AK和TraesCS2A01G070100-JD都能将麦黄酮(mr1058)转化为麦黄酮7-O-葡糖苷(mr1275)，但TraesCS2A01G070100-AK的麦黄酮-7-O-葡萄糖苷的生成速率比TraesCS2A01G070100-JD低一个数量级(图4F)。对麦黄酮(mr1058)含量在两亲本之间的差异进行分析，发现含量差异与在JD期的表达水平明显高于AK期的差异是一致。

另一种麦黄酮衍生物麦黄酮7-O-丙二酰葡萄糖苷(mr1093)，该代谢物在GK期定位于4B染色体上43.22-46.62Mb的区间(图4G)。位于位点区间内的T和(43.79Mb)被指定为潜在候选基因(图4G)。这两个候选基因都被标注为花青素5-芳香酰基转移酶，并且与水稻同源基因和具有高度的序列相似性(图4H)。随后，用纯化的蛋白进行体外酶活实验，结果表明比产生的麦黄酮7-O-丙二醇糖苷更少(图4I)。同时，对这两个候选基因在三个阶段的表达情况进行分析发现，的转录本水平远低于，因此可以优选作为该mQTL的候选基因。虽然在的开放阅读框中没有发现序列变异(图4G)，表达水平也没有差异，但在两亲本之间，麦黄酮7-O-丙二酰葡萄糖苷(mr1093)在JD中MK期含量较高。

图4参与麦黄酮代谢的候选基因的功能注释

5.根据动态mQTL解剖代谢途径

除了上述位点(在三个发育阶段中的任何一个获得的mQTL，图3-4)，mQTL可能与结构相似的代谢物动态关联，这意味着这些mQTL可被用来尝试进一步描述代谢途径。具体来说，代谢产物链mr1058(麦黄酮)-mr1275(麦黄酮7-O-葡糖苷)-mr1093(麦黄酮7-O-丙二酰葡糖苷)可以被认为是麦黄酮的顺序化学修饰，其中编码甲基转移酶、葡萄糖转移酶和丙二酰转移酶的相关候选基因已经被鉴定出来(图4)。这些mQTL在三个发育阶段中的任何一个都被定位(图4A、4D和4G)。另外，作者观察到上游的候选物可以同时被代谢物链的下游代谢物所映射，这表明上游的mQTL可能还会影响下游代谢物的含量(图5A)。如甲基转移酶(由编码)可导致麦黄酮的产生(图4C)，该候选基因位于代谢物链的上游，相关位点(7A染色体上32.00-35.00Mb)与所有三种含麦黄酮骨架代谢物共定位(图5A)。同样，葡萄糖基转移酶(，图4F)相关的mQTL(2A染色体上35.84-36.88Mb)与衍生物(麦黄酮7-O-葡糖苷：mr1275和麦黄酮7-O-丙二酰葡糖苷：mr1093，图5A)共同定位，而丙二酰转移酶(，图4I)相关的mQTL(4B染色体上43.22-46.62Mb)仅与丙二酰化代谢物麦黄酮7-O-丙二酰葡糖苷（mr1093）相关(图5A)。作者推测，上游候选基因的改变可能会导致候选基因的直接催化产物及其下游代谢物含量的波动。事实上，在小麦中过表达(编码葡萄糖基转移酶)后，其在FK和GK期小麦籽粒中的表达水平升高(图5B)。同样，与野生型相比，麦黄酮7-O-葡糖苷和麦黄酮7-O-丙二酰葡糖苷的含量都显著高于野生型，而麦黄酮的含量变化不太明显(图5C)。

尽管有上述例子，但重要的是要注意，对于代谢途径来说，这种模式并不总是如此。事实上，与过表达系类似(图5B-C)，-JD过表达的小麦籽粒中FK期只有作为直接催化产物麦黄酮的含量增加了(图5D-E)。一种可能的解释是，在三种酶之间介导的代谢物通量效率有差异，因此，当这三种酶同时以相似的量存在时，不同的代谢物通量效率(由图5A中箭头的厚度表示)可能会导致更少的麦黄酮被葡萄糖化，而葡萄糖化的麦黄酮将在下游大量丙二酰化，生成麦黄酮7-O-丙二酰葡糖苷。为了验证这一猜想，随后将0-JD和T-JD加入到反应混合物中时，产生的麦黄酮的数量级相同，产生的麦黄酮7-O-葡糖苷大约少三个数量级(图5F)。同时，在混合物中加入后，几乎所有通过-JD催化反应生成的麦黄酮7-O-葡糖苷都被进一步用于生成麦黄酮7-O-丙二酰葡糖苷(图5F)。

在上述实验中，作者已经证明了结合来自三个连续种子发育阶段的mQTL在解析代谢途径方面的能力。根据这种方法，可以鉴定更多的候选基因，并可能揭示相应的代谢途径。例如，2A染色体31.78-36.88Mb区间上与金圣草黄素7-O-葡萄糖苷相关的QTL为(31.20Mb)被指定为候选基因，该基因与其水稻同源物具有49.31%的序列一致性。沿着这种思路，作者在目前的研究中已经成功地指定了许多其他mQTL的候选基因。表1和图6中显示的候选基因与黄酮类、氨基酸及其衍生物和酚酰胺类等多种代谢物相关，这证明了目前研究中使用mQTL方法鉴定候选基因的有效性。

图5麦黄酮代谢途径的解析

图6定位的mQTL的候选名称

迈维小结

作者利用159个重组自交系(RILs)群体，对籽粒灌浆粒(FK)、成熟粒(MK)和萌发粒(GK)三个发育阶段的籽粒进行了广泛靶向的代谢分析。共检测到625个带注释的代谢物，在FK、MK和GK中分别定位到3173个、3143个和2644个代谢物数量性状位点(mQTL)。只有52个mQTL在所有三个阶段同时被定位，表明小麦籽粒代谢组具有较高的阶段特异性。随后，在小麦中通过体外酶促反应和/或转基因方法对四个候选基因进行了功能验证，其中三个介导麦黄酮代谢途径。同时，对麦黄酮通路内的代谢物通量效率和优势候选单倍型进行了评估。最后，进一步重建小麦代谢途径。

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